2015版中国药典微生物项变化的应对策略：设备（二）

前几年，很多微生物实验室在调研购买何种类型的微生物鉴定系统，我们实验室的鉴定设备是使用生化方法鉴定的设备（表型鉴定），相信现在大多数的实验室还是在使用生化方法去进行鉴定，不论使用设备或者API等手工板条进行鉴定，也有部分实验室使用分子方法（PCR+测序）进行鉴定，但碍于方法的局限、菌库的数量及鉴定的程度，实际检出率和准确率都不是很理想。

《9204微生物鉴定指导原则》的内容对于现在大多数的药企针对性和指导性都很强，其中介绍的技术包含了现在药企实验室可用的几乎所有的鉴定方法，个人觉得这篇指导原则是微生物指导原则中的干货，指导原则中的内容就不在本文中多加赘述，以下简单介绍一下微生物鉴定方法及微生物设备的选型。

1、鉴定方法简介

    微生物鉴定原则：表观水平→生化水平→分子水平，微生物鉴定应遵循逐步缩小范围的原则，依据分类学知识，将微生物逐步落实到科、属、种。

各类微生物的菌落特征就不在这里列表了，在很多微生物书籍中均有介绍，进行微生物鉴定的人员应对各类型微生物的形态特征做到心中有数。不管使用何种方法进行微生物鉴定，都应对微生物进行纯化，至少分离到纯培养物后再进行后续鉴定。

现有的鉴定技术分为表型鉴定、基因型鉴定和色谱光谱鉴定。表型鉴定基于表观生物学活性，如营养物质代谢试验、碳源和氮源利用试验、各种酶类试验、API试验条等；基因型鉴定基于核酸物质，如16SrRNA分型、核糖体分型和脉冲场电泳试验；色谱光谱鉴定基于全细胞信息，如傅里叶变换红外技术。

1）  初筛试验

流程基本就是分离纯化→革兰氏染色（芽孢染色、KOH拉丝试验）→生化筛选（氧化酶、触酶、凝固酶）→根据上述结果筛选板条→孵育规定时间人工读数或机器读数→结果对比系统中的标准微生物特征得出鉴定结论。

革兰氏染色镜检对于鉴定人员的技术及判断经验有一定要求，这步是很关键的一步，但这个没有捷径必须是多做才能总结经验的，很多时候一些球杆菌、芽孢菌等的形态和染色结果均依赖镜检人员的经验，有些在无法判断的情况下，可以使用KOH拉丝实验进行辅助判断，但我们实验室不用其判定革兰氏染色结果，大多数革兰氏阴性菌在5-10S内出现阳性反应，有的则需30-45S，假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌、产碱杆菌等大多数在10S内呈阳性，不动杆菌、莫拉菌反应较慢，大多数菌株在60S内出现阳性，而革兰氏阳性菌在60S以后仍为阴性，其主要用于革兰氏阴性菌与易脱色的革兰氏阳性菌的鉴别。

生化筛选中的三种方法，氧化酶试验是将革兰氏阴性杆菌分为非发酵菌（如假单胞菌）及肠道菌（如肠杆菌科）；触酶试验，也叫过氧化氢酶试验，用于革兰氏阳性球菌的鉴别，葡萄球菌和微球菌呈阳性反应，链球菌及肠球菌呈阳性反应，但是需要注意的是肠球菌多假阳性情况；凝固酶试验，区分致病性及非致病性葡萄球菌，金黄色葡萄球菌多阳性。

初筛试验是鉴定的最关键步骤，若结果错误会影响后续试验，包括微生物鉴定试剂盒和引物的选用。

2）表型鉴定

这里必须介绍下生化鉴定的始祖API试条，这个相信很多实验室还在使用，是全手工的方法，流程是接种物的制备（以上的生化鉴定全部完成）→试验条的筛选（根据之前生化鉴定结果选择）→试验条的接种→试验条的判读。这个方法其实很多实验室即使买了设备也没法摈弃，如果设备坏了还是需要手工方法进行试验，成本相对低廉，15种试条可鉴定细菌550种，但是人工判读结果的有较大误差（看色判读），也是需要相当经验值，我们实验室如果碰到判读有异议，一般会由2人一起对结果进行判断，达成一致后再输入鉴定结果。

表型微生物鉴定太依赖于其本身的表型特征，实验室很多时候在初次鉴定时的结果并不理想，在二次鉴定时得出可接受的鉴定结果，从初始培养物中刚分离出的受损的次代培养物可能不能进行完整的基因表达。

在指导原则中提到“表型微生物鉴定方法已广泛应用于药品微生物实验室，根据微生物表型鉴定所提供的信息可以判断药品中污染的微生物种类，也可掌握环境微生物菌群的变化，并进行产品的风险评估。在许多质量控制调查中，单独的表型鉴定结果就能给出充足的信息帮助调查人员进行深入调查，并按需要制定适宜的纠正措施。”该类鉴定方法虽有一定局限性，但是是最常用的鉴定方法。

3）基因鉴定

    基因相较于表型来说差异相对比较少见，且基因型的明显差异说明其并非同种或同属，理论上，基因型微生物因核酸序列高度保守所以其鉴定结果更可靠，其通常不受生长培养基等的影响，只需分离到纯菌落便可用于分析。

最常用的方法就是通过比较细菌16SrRNA或真菌8SrRNA基因的部分碱基序列来实现，即经过PCR进行基因扩增、电泳分离扩增产物、以双脱氧链终止法进行碱基测序，然后与数据库进行比对，有的微生物实验室直接使用该方法进行鉴定。我们实验室也正在进行生化鉴定和该方法的比较试验，日常使用生化方法，关键事件的调查准备两者结合使用或委外使用色谱方法进行综合鉴定。

当然，基因型鉴定虽然比表型鉴定的准确率和检出率会有一定提高，但是基因型数据也有一定的局限性。鉴定系统同样不能鉴定所有的微生物；需要昂贵的分析设备和耗材；通常仅有关键的微生物调查才会应用；仅凭基因型数据作出的决定，对于考虑微生物特征，测试历史及微生物来源是没有意义的；当今伯杰氏手册中的分类学手段基于遗传物质并非遵循表观水平，导致一些已知的微生物分类学发生改变及重命名（如黑曲霉ATCC16404）。

在指导原则中提到 “基因鉴定法不但技术水平需要保证，还需要昂贵的分析设备和材料，通常仅在关键微生物调查中使用，如产品不合格调查。若使用，方法必须经过确认。”所以若使用基因鉴定的方法一定要进行方法确认，确认的方法在指导原则中有详细描述。

2、设备选型

在选择是否购买设备、买何种设备前，必须了解各类鉴定原理。很多人会问哪个技术更好，越是后端发展的技术越是鉴定的准确那是无疑的，而且有些设备可以进行溯源调查，这也是大家对于OOS结果调查中希望开发的模块，当然传统的生化也不用摒弃，可以结合一些表型鉴定对鉴定结果进行分析和判断。

设备选型至少应考虑以下几点：预算、设备菌库量、设备一次最大检验量、检验时间、检验过程复杂性、检验结果溯源性、做1TEST的成本、设备的维护成本等，以下挑重点项讨论。

预算的多少其实直接决定了选择哪个鉴定原理的设备，现有鉴定仪器的实验室基本买的都是表型鉴定设备，价格比较能够接受，其他方法设备相对较昂贵，有溯源功能的设备价格更甚，后续的实验成本也不便宜。企业可以根据预算量进行考虑，但是基因及色谱光谱法一定是菌鉴发展的趋势。

菌库量是必须要考虑的问题，很多设备的销售会对外宣传他们设备的菌库量很大，听到这样的介绍我们先要冷静，先确定其菌库是否是指临床的菌库，因为在药企的生产车间污染的菌很多和临床是不一样的，我们药企应至少偏向于工业微生物的菌库，如果不清楚如何区分，还有个简单的也是在购买前必须要做的试机过程，就是将自己环境菌库中的已知微生物让他们上机进行鉴定，特别是有些生长缓慢或当初鉴定时就比较难鉴定的菌株，如一些非发酵菌、棒状杆菌等，比较鉴定结果。同时有些设备的菌库会定期进行更新，应提前询问好供应商菌库更新的附加成本是多少，以便于及时补充菌库量。

检验的复杂性、时间、一次检验量及其成本是设备日常使用过程中的重要参考项。如检验的复杂性是指人员手工需要处理样本及上样的时间，人工参与的时间越多结果的不可控性就越高，全自动设备的好处即在于减少人为操作的步骤和时间，当然对于一些使用生化鉴定原理的设备，如有的4-8小时即出结果，但有些非发酵菌生长缓慢，可能就会影响其鉴定结果。

购买鉴定设备细节较多，还是要根据各自企业的现状进行筛选并在URS上写清，若无预算也可使用API手工试条进行鉴定。

三、其他设备

药典升级后一些常用设备需要增加，特别是培养箱等，本次很多培养温度均进行了调整，需要考虑培养箱确认及日常校准温度点的调整，如微生物限度霉菌及酵母菌总数温度、控制菌中大肠埃希菌使用温度等。

还有就是生物安全柜的增加，如鉴定需要，还有就是中检所的老师也推荐微生物限度使用生物安全柜，处于既保护检品又保护人员的考量，这也是企业可以考虑的一点。

微生物的辅助设备这次也可以一并考虑，如自动菌落计数器等可以帮助提高实验效率的仪器。

本次药典升级带来的设备升级或新增对于微生物实验室是一次不小的挑战，但也是与国际药典接轨的非常重要的一步，我们微生物实验室也不应满足现有的传统试验方法，应多了解和接触一些前沿设备，如微生物快速检验设备等，将微生物的检验技术不断推进。