2015版中国药典微生物项变化的应对策略:检验方法

随着药典培训陆续的展开，微生物的专项培训也在全国如火如荼的举办，对于检验方法的讨论也是授课的重点项目，这次药典的升级，我们微生物检验方法中使用的环境、培养基、菌种甚至一些关键耗材的均发生了改变，所以方法适用性试验避免不了的需要重新进行确认。那对于最早8月中旬才能看到药典最终内容的很多企业来说，在今年的12月之前把所有出厂产品或原辅料/中间产品的微生物方法适用性试验进行完也是相当不易，甚至是无法完成的。
 
  本篇文章着重梳理应对药典生效前后进行检验方法学的流程及关键点，由于各企业各产品的特点不一，内容阅读前提是贵公司各供试品的方法适用性试验步骤大家是心里有数的，若还在方法摸索阶段请参照15版药典方法及各类培训及书籍推荐的方法先进行供试液制备方法、滤膜、冲洗量的确定，故本篇文章不对实验细节进行赘述；同时简述在方法学完成前后如何对整个岗位管理类和操作类SOP进行梳理升级。
 
一、方法适用性试验前的准备

1、 确认要进行方法适用性试验的供试品

  一般分为出厂产品、原辅料、中间产品等，如果时间紧张，比如企业在16年就要再次认证，且需要进行验证的供试品多，建议可以和领导讨论进行评估，先对出厂产品的方法学进行验证然后再进行原辅料及中间产品的同步验证，当然这个需要留下纸面的经审核批准的评估结果，对于微生物实验室的人来说也是个执行依据。
 
  如果不是新建企业的话，之前的那些供试品均按2010版药典进行过验证，基本上来说可以按之前的供试品制备方法和冲洗量进行验证，那对于实验室人员而言，除了实验环境需要重新适应，其余的培养基和菌种只要记得别加错就好，其实也是驾轻就熟的，而且实验的结果也不会太令人失望，这里仅指大多数做过验证的有检验方法的供试品，也会有部分供试品无法直接复制，还需前期进行方法摸索，但是不论如何都要以严肃严谨的态度对待每一个方法学的验证，因为这个是今后检验方法的依据。
 
2、 确认方法适用性试验需要的环境

  这里的环境包含洁净室、阳性室、隔离器等设备，在进行方法适用性试验前，这些环境均需要通过确认合格并满足方法适用性试验的环境条件后方可使用，这里还有个偷懒的方法，如果隔离器不是今年新买的，之前已对隔离器进行确认且已熟悉使用，今年要重新进行隔离器的PQ确认，其中的包装完整性测试也可以和供试品的无菌检查方法学同步进行验证，当然这个是在实验室有一定成功把握的前提下，否则不建议一起验证，还是老实点分步进行。
 
3、 确认方法适用性试验需要的物品

  各供试品方法适用性试验需要的物品不同，但是供试品、培养基和菌种是肯定要的，在进行方法适用性试验前必须针对每种供试品列出需要物品的清单并经所有验证参与人员确认，这样便于实验时不遗漏。在供试品量的确认中，必须严格按照药典的检验量进行。
 
4、 确认方法适用性试验参与人员

  理论上来说，经过方法适用性试验的人员才能进行该供试品该方法日常的检验工作，但是现实情况是实验室人员流动率不低，部分人员并未经过方法适用性试验，但是在每次方法适用性试验时，必须界定现有人员中现有及今后参与该类实验的人员名单，尽量让其参与方法适用性试验的流程中去并且理解整个验证过程的内容和意义，这对于今后开展实验会有很大的帮助。
 
5、 制定方法适用性试验时间计划

  确认了以上4条内容后，并结合实验室现有的正常工作就可大致计算出每种供试品方法适用性试验需要的时间，必须列成计划并经所有参与人员签字确认，如无异常情况应严格按照时间表进行验证，这样才能保证不影响整体的部门药典升级大计划。
 
二、方法适用性试验的实施

  本次药典升级在微生物限度检查和无菌检查这2大方法的适用性试验的流程和判定标准在各类培训中其实已经讲的相当详细了，我就再提一下比较容易忽略的几个方面。

1、 无抑菌性供试品的方法适应性试验必要性

   曾经有次培训遇到也是药检所的老师，哪个地方的我就不透露了，说如果你们企业能够确认该供试品无抑菌性则可以不做微生物计数方法适应性试验，当时我就对该观点持有保留态度，这次QC微生物的同事从中检所举办的培训回来带来的观点也恰恰印证了这一点，所谓的对供试品中污染菌的影响并不单单指供试品的抑菌性，还有整个操作过程如供试品的制备过程、冲洗液的种类、冲洗量及次数，同时和使用的滤膜和滤器可能带有的残留抗菌物质也有关系，所以保守起见还是建议进行方法适用性试验。
 
   还有很多同行会问注射用水和纯化水是否需进行微生物计数方法适应性试验，这个的话我们企业是不进行的，但我没有寻求过检验所老师的意见，大家有兴趣可以去咨询下。

2、 供试品方法适应性试验的次数

   这里的次数有三个版本，第一、使用三个不同批次的供试品，每批各进行一次试验；第二、使用同一批次的供试品，进行三次试验；第三、使用一批次供试品，进行一次试验。现在没有进行硬性控制，可以按企业不同的需求和能力使用风险评估的手段得出结论，但是如果三个不同批次或同批次三次试验的供试品试验结果相差较大，则应增加批次供试品参与适用性试验。现在国家对于实验室的管控没有那么教条化，而是根据不同实验室的能力水平自行进行质量风险的控制，这也不失于一种进步。
 
3、 无菌检查检验量的变化

    本部药典中很明显的一个变化就是无菌检查检验量的调整，计算下来基本都是增加了检验量，特别对于生物制品来说，两张表很容易看不明白，因为本次生物制品还是三个套筒，表1是批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量，上面写了接种每种培养基的最少检验数量，生物制品是20个；表3是供试品的最少检验量，上面写了每支供试品接入每种培养基的最少量，生物制品是半量。那这样的话，如何既保证每种培养基的最少检验量20支又保证每支供试品接入每种培养基的最少量满足半量呢，我们本来就是三个套筒，那进样死活都是TSB肯定是三分之一量呀，经过好几次药检所的咨询，这个量的问题是总量的概念，而不是表面意义上的量，所以如果生物制品是20个，那供试品的检验量最少就是30个，供试品阳性对照的检验量是10个，一次无菌检查实验的供试品量是40个，检验量这个大家需要好好去了解和理解一下，避免方法适应性试验及正式检验的检验量错误。
 
4、 试验中的加菌时机

   在10版的药典中，不论微生物限度还是无菌检查，加菌的步骤都在最后一次冲洗液中，但是15版药典有了调整，在微生物计数方法中，在试验组中在供试液中直接加入规定量的菌液，之前一直认为这样更加真实的反应了供试品中的微生物在整体试验中受到的影响情况，但是！在本次中检所在上海的培训中，培训老师也说了该方法主要针对平皿法，如果是薄膜过滤法，如果供试品的抑菌能力并不强的话建议加在最后一次冲洗液中，还是要看供试品的种类定义，无菌检查没有例外是在最后一次冲洗液中加菌。在最后一次冲洗液中加入阳性菌，给出的理由是：第一、主要是增加考虑滤器的有效性；第二、滤器的有效性应由企业控制，用户可采用适当方法抽查（如检查阳性菌液通过滤筒的流出液）；第三、验证实验主要考虑滤膜/滤器残留抗菌物质对阳性菌生长的影响，可以与对照滤筒比较而做出判断，所以验证试验中的加菌时机与方式只要与对照一致即可。这话又自己圆回来了，反正还是那句话各实验室见仁见智，最终版本的药典还是没有拿到手之前还是不要先下定论，毕竟检查的老师很多还是按章办事的。
 
   另外这里再说一下在隔离器内无菌检查加菌的问题，因为隔离器内放置的物品都要经过外表面消毒，至少也要经过几个小时，所以不建议提前将带有菌液的冲洗液带入，如果试验不成功无法证明因为过程试验过程导致，也有可能菌液在室温放置时间过久而致死亡，而且大多企业也不会在阳性室再买一台同样的集菌仪专门进行验证使用，所以也咨询了一些知名外企，他们是在做完整套实验后，在阳性室使用注射器将规定量的菌液加入制备完的套筒中，但是我也咨询过中检所的老师，他是建议企业再购买一台一样的集菌仪在阳性室完成试验，所以大家可以根据自己企业的实际情况进行选择。
 
   在这里再提一下方法适用性试验的意义。无菌检查：进行供试品无菌检查时，所采用的检验方法和检验条件应与验证的方法相同。微生物限度：检查时，应按已验证的计数方法进行供试品的需氧菌、霉菌及酵母菌总数的测定，供试品的控制菌检查按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。也就是说，在正式检验供试品之前，该供试品的检验方法必须经过方法适用性试验确定，并按该方法进行供试品的检验。
 
三、岗位SOP的梳理和升级

   我们微生物实验室有5份管理制度，近40份实验操作规程，近20份设备操作规程，因产品比较单一，应该比一般微生物实验的文件少一些，但无外乎就是人机料法环5个板块的内容，其实在之前的连载中，已经把人机料环都进行了较详细的赘述，所以在方法适用性试验前，可以对其他板块的SOP进行先行的修订，当然管理制度应先于操作规程，因为作为纲领性的内容必须先领出整体的管理思路，后续操作规程的方向按照大的管理思路去修订即可。在药典还未到手或生效前，已可以根据第三版征订稿进行修订，再等后续确认内容进行核对和微调即可。
 
   我们微生物实验室的文件修订从15年初就开始了，每个成员均有负责的文件，每月均有必须完成初稿的文件，并在次月对该文件的框架和内容进行审核和修改，这样在后续方法适应性确认后及药典正式稿确认后，调整的地方就不会太多。所以建议大家在应对药典升级的过程中就可以开始对SOP制定升级计划并逐步实施了，因为这块的工作量也是很大的，分散在各个时段和各个检验负责人手上，可以让大家循序渐进的将药典升级的工作融入日常工作并逐步深化药典的内容，使得应对过程和结果不流于形式。