微生物限度检测风险与控制

微生物限度检查是对生产单位所用的药品原料、器具设备、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生评价的综合依据。由于微生物限度检查程序繁琐，操作 严格，检查周期长，干扰因素多等原因都会造成检验结果误差，这样难以对生产做出系统、科学的管理。现就微生物检查时，容易引起误差的几个方面原因以及控制方法分析如下。

风险一：检验方法

微生物限度/生物负载检验是对待测样品中的微生物含量进行精确测定的实验。其实验方法分为培养基法和薄膜过滤法两大类。

薄膜过滤技术是20世纪60年 代以来发展起来的一项分离技术，它具有操作条件温和、无污染、无相变等特点，在许多方面都得到应用，如用于微生物检测。薄膜过滤是通过使用一定孔径的滤膜 从液体中截留微生物，然后将其放在培养基上，使该微生物在膜表面成长为菌落，最后对其进行培养、计数、鉴定等。薄膜过滤方法不仅可用于饮料的微生物检测， 也可用于冲洗水、加工水、污水中的微生物检测，是一种国际公认的微生物检验方法，得到了AOAC、美国、欧洲和日本等国家的药典、FDA和EPA等组织的承认，广泛应用于制药工业、食品及饮料工业、环境监测、化妆品品质控制和电子工业等领域。

与培养基法相比，薄膜过滤方法具有以下两大优点：

1. 提供更准确的检测结果：薄膜过滤法可以从大量的液体中富集少量的微生物，与传统的检测方法相比能够提供更为精确的检测结果，也可减少在检测过程中取样不均而导致的假阳性，检测的灵敏度可达1CFU。

2. 可以通过冲洗去除抑制性物质（如防腐剂），从而降低抑制剂对检测结果的影响。

采用薄膜过滤法,滤膜孔径应不大于0.45um,直径一般为50mm,若采用其他直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品,其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。

风险二：取样计划

《GMP实施指南》中明确指出样品应具有代表性，应能反映整批产品的情况和工艺情况。只有在对取样方法和分析方法开展相关的验证工作后，才能够根据样品的参数做放行决定或者进行工艺调整。

在允许范围内，取样体积要尽可能大，因为大体积的样品更能够反映产品整体状况。例如对某药厂的制药用水进行监测，纵坐标表示在取样量为1L（浅蓝色）和100ml（深蓝色）时被检测到的铜绿假单胞菌的数量，可以明显观察到取样量为1L 的样品中的微生物计数要高于100ml，但是这个不是严格成比例的。增加取样量能够改善在低数量微生物计数时的不确定性，由此获得更高的精确度和统计学意义上的计数。另外当取样100ml时发现没有微生物存在的情况下，取样1 L可明显发现微生物的存在。因此对于低污染水平，100ml 的取样样本非常明显地增加了风险：在和实际污染存在的情况下误以为系统是干净的。但是当我们将取样体积提高到1L 时这样的风险就被降低了：因为增加取样体积改善了对整个水系统监控的力度。