2015版中国药典微生物项变化的应对策略：培养基

1、 培养基配方梳理

根据自己企业需使用的培养基整理其配方，最终筛选出的培养基必须与2015版药典规定的培养基配方一致，值得一提的是如硫乙醇酸盐流体培养基中的葡萄糖，在中国药典写5.0g，如果后续筛选国外品牌的培养基，其配方上的葡萄糖可能写5.5g，USP上硫乙醇酸盐流体培养基上的葡萄糖写的是5.0g/5.5g，如果一眼看去，可能会直接剔除该国外品牌的培养基，其实并非，中国药典写的5.0g的葡萄糖是指无水葡萄糖，国外品牌配方中的5.5g是指一水葡萄糖，其实是可以使用的。

所以对于配方的梳理相当重要，让我们在第一步的时候不至于走错，否则如果配方不对仅核对名称，那最后买单的可能真的是实验室自己了。很多人喜欢拿着药典直接核对，自己梳理的好处是印象会更加深刻，所有培养基均整理成一个表格，便于以后查找和管理。当然每个物料对于微生物生长的作用，我觉得有兴趣的同学可以了解一下，这对这次药典为什么培养基会变化会有更深入的理解。以下举例TSB

2、 培养基供应商的筛选

这里指的培养基包括培养基干粉及成品培养基，干粉指的是按药典配方生产的培养基干粉，直接溶解灭菌即可使用，成品培养基是指用按药典配方生产的培养基干粉制备出的预灌装的平皿及液体培养基，即配制好的培养基可直接使用。

对于品牌的筛选每个实验室仁者见仁智者见智，都有一套自己的评判标准，如成本或到货周期的考量，但是适用性检查的标准只有一套，那就是药典明确规定的培养基的适用性检查方法。之前有个国内大型企业的实验室主管问我们使用哪家的干粉，她说她们实验室一共就7种培养基，但是涉及到的厂家却有三家，比如培养基1号、2号、3号使用厂家A的，培养基4号、5号是厂家B的，培养基6号、7号是厂家C的，这样一来就真的不好管理，因为你有那么多厂家并不是我们所谓的备选供应商的概念，他是指培养基1号就一个供应商就是厂家A如果A断货或质量有问题就不能选用厂家B或C的；还有一个她现在面临的棘手问题是，厂家A培养基干粉瓶上的建议灭菌温度是115℃、20min，厂家B培养基干粉瓶上的建议灭菌温度是121℃、15min，这样如果配制这2个不同厂家的培养基还不能同一批一起灭菌，因为灭菌温度时间都不一样，那讲到这里大家又会发现一个问题，那就是如果灭菌温度时间不一样，那使用的灭菌器验证时候的灭菌条件又会增加一个，包括空载/满载热分布、满载热穿透生物指示剂挑战那一大堆的事。。。。。。听完以后我真的是为她着急！！实验室资源就在此时被白白浪费，不说水电吧，一支生物指示剂那就要小一百了，还是三次满载挑战！统一的培养基供应商统一的灭菌条件是最便于管理的，相信现在这样的企业应该越来越少了，那正好趁这次15版改版的契机，好好筛选一下我们的培养基供应商！

最好挑选国内或国外大型的培养基干粉生产厂家，这样的厂家的资质审计相对会比较方便资料也齐全，另外我建议至少筛选出2家厂家，这2家厂家的产品最好是包含了实验室需要的所有培养基干粉品种，其中1家是首选厂家，另1家是备选。选择过程中务必结合后续希望使用的成品培养基的情况，因为大家知道现在成品培养基有的是干粉培养基生产厂家直接生产的，也有的是仅进行成品培养基预灌装的厂家，我个人的理念是，干粉选择什么厂家，最好对应的成品培养基的干粉原料也是这个厂家，这样能够最大限度的保证实验数据的稳定。

培养基比较有名的厂家做微生物的基本都耳熟能详，找供应商上门先了解一下大概的情况，同时和供应商交流一下后续审计的内容，因为筛选合格的培养基供应商还是需要实验数据说话的，供应商吹的多天花乱坠也没有实验数据来的有说服力！

3、 培养基供应商的审计

1）资质审计

资质审计审什么？我们QC比较关心的内容基本包含以下一些内容，生产证书、生产工艺、配方、出厂标准、CoA、效期证明、价格、到货周期、外包装耐过氧化氢或其他灭菌剂灭菌证明（一般指在隔离器内经其灭菌剂外表面灭菌后使用的成品培养基）、辐照厂家辐照剂量、如国外供应商则应有进口批文还有国内授权代理书等，可参照各企业QA的供应商审计中的资质审计进行。理论上，在资质审计完成后，才能进行适用性审计，但是如果对这家供应商非常有信心，两方面的审计也可以同步进行。

2）适用性审计

适用性审计基本上就是对培养基进行药典规定的适用性检查实验，但是对于商品化的东西我们还是需要加入一些其他的检查项目，我们实验室的检查项目分四个：外观检查、pH检查、无菌性检查、灵敏度检查。

干粉我们这里是选取每个品种的其中一批进行检查，因为原本就计划干粉和成品培养基的干粉原料是一个品牌，成品培养基的每个品种我们均进行三批次的检查，且每批次均包含首次试验及末次试验，首次试验即收到样品后直接进行适用性检查，合格后按要求贮存到规定效期时再进行末次试验，首次试验和末次试验的检查项目是完全一致的，确认其在规定贮存条件的有效期内适用性检查仍符合实验要求，也有的企业是在效期过后一周内进行，那更加具有挑战性，其实这个看不同企业需求，虽然有的成品培养基是6个月，但是实际使用当中不会使用到那么长时间，那在近效期的时候进行末次试验无可厚非，但是基本上厂家效期验证肯定是做到效期之后的就如同我们药品一样，所以在效期过后的一周内进行末次试验对于该培养基的考察更有意义，当然若末次试验不合格可能面临与供应商沟通的问题，大部分供应商是认账的，但也不排除一些比较计较的说你们是在效期过后试验，所以试验结果我们不认。

适用性审计中的各个检查项目，在这里我也大致的说一下，外观检查项和pH检查项是我们自己加入的检查，外观检查项的话比如外包装是否完整、培养基的颜色是否正常等，pH检查项在干粉配制成液体培养基或者是成品培养基的确认时就很有帮助，比如我们就遇到过成品培养基刚来是合格的，但是贮存到近效期其pH就跌出下限了（特别注意SDA）。在这两个基础检查项均合格后，才进行后续无菌性检查和灵敏度检查，这两项就是完全按照药典规定来进行的，特别提醒的是回收率的对照品应使用中检所对照培养基。四项检查均合格则判其适用性审计合格。

以下是我们实验进行培养基干粉及成品培养基的部分列表，因涉及到供应商所以把其名称、货号、批号和价格隐去。

在上表中可以发现有些公司的成品培养基还是有这样那样的问题，当然厂家也解释说因为其产品为辐照产品，我们使用的是中检所的对照培养基未经辐照，所以回收率会不合格，但是最终我们还是要符合中国药典的标准的，所以我们没有让步。还要就是若实验做出来结果不符合要求应先确认实验室的实验结果，我们这里确认不合格的实验次数起码是三次，确认结果后再和供应商进行沟通，后续应进行供应商实验室和我们实验室的对比实验，最终确定产品是否有问题。

4、 培养基的包装

这个单独列一条进行讨论是针对自配及商购的成品培养基而言，其包装对于日常使用、贮存有着很大的意义，不知道大家在用别的厂家买来的预灌装的培养基有没有细心观察过其包装，以下我就预制平皿及液体培养基大致分析一下现状。

1）预制平皿

预制平皿的商购包装我看到过三种，基本都是三层包装，一种是平皿放置的习惯为5+5就是横着放，袋子手感比较薄的，但是优势是该袋子可降解，且因为有一定透气性，平皿内部不易产生水滴。第二种是最里面2层是呼吸袋，最外面一层是聚乙烯材质的塑料袋。第三种是最里面一层是聚乙烯材质，外面2层是呼吸袋，后面2种均是竖直放置10块平皿现在用的比较多。

不管材质如何，一方面我们要考虑平皿外包装对于内置平皿的贮存无菌保证、水分的流失以及使用时候拆包的方便性，另一个很重要的是对于今后放置于隔离器内经外表面灭菌后，该包装对隔离器灭菌剂的穿透性，这个的话首先需要厂家提供的验证证明，如防过氧化氢穿透的验证证明，同时在后续讨论的隔离器的验证中也要进行检测，毕竟每个企业的隔离器内灭菌的浓度和时间均不同。

若自配预制平皿，有很多公司还是临用现配的，基本其有效期为7天（按药典要求），但我这人比较懒，希望能多用一段时间，也便于管理，所以进行了100天的贮存效期的验证，制备好预制平皿进行预培养，预培养后进行平皿挑选，合格的平皿用两层袋包装后贮存使用，效期三个月，用下来还是比较不错的。

当然自配和商购的各有利弊，自配的回收率可能高于商购的（基于同一品牌干粉而言），因为商购需要进行终端灭菌，终端灭菌方法对某些菌的回收率会有一定影响，而且一批辐照批次的产品，可能放在各个位置的均匀度不够好，会导致一条10块的平皿中，5块是好的另5块不太好，以上问题在国外购买的成品培养基上没有发现，但是国内生产成品培养基的某些厂家确实会有上述问题，所以辐照效果的考察在国内生产成品培养基的供应商审计的时候必须更加注意！但是商购的每块平皿的灌装量和追溯性比较好（每块有喷码批号有效期），包装的密封性更好。

2）液体培养基

对于液体培养基，现在很多实验室用铝盖胶塞对输液瓶进行密封轧盖，该类密封性的包装可以延长液体培养基的贮存时间，但是对于实验室自己使用自动轧盖封口机进行轧盖及灭菌的实验室而言有两点隐患。

第一，灭菌安全性问题。

灭菌时温度升高里面的水部分变为水蒸气，但因为密封包装，所以瓶内压较大，在灭菌时有爆瓶几率，而且在灭菌后，因为培养基不能一直放置在灭菌器内，内部温度高会导致培养基颜色加深，培养基内的成分可能有一定破坏，故一灭菌完成，压力表归零，灭菌器腔体达到开门温度要求后，立即将培养基瓶取出，但是这个时候，瓶内培养基的温度还是相当高的，在取出的时候势必对培养基瓶有一定的晃动，之前的爆瓶率在这个时候还是存在的，这个也是因为我们有实际的案例，所以大家一定注意使用安全！

第二，包装可能引入污染问题。

灭菌的温度一般为121℃、15min，但是轧盖使用的铝盖和胶塞以及轧盖的环境可能会导致铝盖及胶塞间有部分微生物在该灭菌温度时间无法全部杀灭，有导致污染的可能，实际操作过程中也发现实验室使用的所谓的自动封口机对于输液瓶的封口并不那么严密。现实环境是一般实验室会使用国产的铝盖、胶塞和输液瓶，若本身该企业的产品为输液瓶，则实验室可以借用生产的条件对实验室培养基进行包装，那这就最好。但是多数情况下，实验室还是需要单独制备，因为实验室铝盖、胶塞和输液瓶使用的量较小，所以很多产品好的厂家是不会销售这些产品给QC的，所以现实情况下QC使用的铝盖胶塞和瓶确实不理想。

那很多人会问，那我后续做无菌检查要使用隔离器，我也不可能使用非密封包装形式的培养基呀，这样我只能使用商购的成品培养基了吗？那太贵了！老板也不同意啊！好既然这样我就把我们企业自己发明的包装形式贡献给各位微生物检验的同胞，筛选瓶子用挺多时间，终于筛选出一个相对比较满意的输液瓶了，输液瓶是玻璃的，瓶口是旋转的，瓶盖的顶部是胶塞，便于无菌检查的扎针，灭菌前将该瓶口拧紧后回旋半圈（灭菌时保持内外压，减少安全问题），然后瓶身外套一层呼吸袋封口，灭菌后隔着呼吸袋回拧半圈拧紧瓶盖，至于回旋的位置因为隔着呼吸袋去旋转很难掌握是否拧紧的位置，所以我也想了个办法，灭菌前瓶口拧紧时，在瓶盖和瓶身上竖直贴上灭菌指示带，然后用剪刀横向剪断瓶盖和瓶身的条带，然后回旋半圈，待灭菌完毕后，回拧至瓶盖和瓶身的灭菌指示带呈一直线即拧紧，见下图。

当然这个包装必须能经受隔离器内灭菌剂灭菌的考验，我们进入洁净室就脱去外部呼吸袋的包装，然后进入隔离器就是瓶子，至少经我们实验室隔离器的验证，能防止过氧化氢的穿透，同时用该包装贮存硫乙醇也可以保证三个月的效期（大家可以挑战更长时间的效期，因为硫乙醇氧化层和厌氧层的比例在该包装里确实保持的不错）。日常管理的话每次配制只需换瓶盖的胶塞即可，当然了瓶子和瓶盖我买的是国外的，胶塞我就买国产的了，成本一定要考虑，该用好的用好的，该省的就要省。当初筛选的压力和工作量还是很大的，希望还在摸索中的实验室不再和我们一样走弯路，这次就把这个包装贡献出来，希望对大家有帮助，也希望我们中国药企的微生物实验室能够在这种细节上多交流，共同进步！同时也感谢一些商购培养基和中检所实验室的培养基包装对我们的启发。

说了那么多，最后说一下商购液体培养基，这个我真的是要赞国外的培养基，确实非常不错，当然我现在也非常希望国内的液体培养基能够加把劲，因为国内的优势真的是供货时间和价格，这对于企业还是具有相当诱惑力的，我们也不希望都被国外所垄断，但是质量真的是最高的一个门槛。对于企业来说，购买商购液体培养基在这次15版药典升级后绝对是个使用趋势，其包装最重要的无外乎就是无菌性、灵敏度、包装耐隔离器灭菌等。这点国外的液体成品培养基各类包装形式及基本资料都非常齐全，实验室可以根据自己的需要选择相应的包装形式，供应商肯定在商品介绍时就会一并帮助挑选，之后符合审计要求就可以纳入合格供应商的目录使用。

5、 对照培养基

对于中国药典在2010版引入对照培养基的概念，我个人是相当赞成的，就像理化试验使用的标准品一样，中国很多企业使用的培养基干粉质量参差不齐，导致最终实验结果的误判，这样的损失真的是企业所无法承担的。

中检所这次对于新引入的培养基对应对照培养基是相当重视的，现在还在进行对照培养基的筛选工作，如果大家实时跟进中检所的官网的话，可以发现TSA这个培养基的对照培养基已进行更换，其原来的克数是12g/300ml，现在是11.1g/300ml，当然要进行培养基的适用性审计，我们还是需要某些培养基的对照培养基的，所以实验室必须尽早做出审计计划购买对照培养基，一般是通过省所去中检所进行购买，我们一起希望在2015版生效之前，对照培养基能够齐全吧！

6、 培养基的管理趋势

借鉴著名外企微生物实验室的管理模式，微限、无菌、环境检测的培养基均商购，然后进厂检验放行后使用，在产品检验完成后，再次进行结束检验，确认在使用过程中，该批培养基均符合使用要求。

现在实验室的培养基管理已经慢慢倾向于系统化的管理，很多外企使用商品化的培养基、商品化的定量菌株等，这样将人员的专注力集中于实验本身，其实这也是种风险共担的管理模式，让专业的人去做他专业的事情，在前端对商购的培养基进行严格的供应商审计，这样也省却了实验室若出现OOS结果对自配培养基从配制到灭菌到贮存等在实验室发生的一系列的调查，商购培养基可能只需对贮存、使用等进行调查即可。

从成本上考虑，我相信国内的成品培养基生产企业也会跟上脚步，这样对于国内药企来说，实验室自配和商购成品培养基的成本其实相差并不大，企业自身的人员管理压力和成本压力也会相应减小。

所以回到之前的话题，培养基的筛选和供应商审计就显得格外重要，我们要把困难的事情往前做，这样我们就会有更多的精力去解决我们更重要的技术问题。培养基的管理是不断进步的过程，我们实验室碰了不少壁，但是收获更多，相信大家肯定会有更多更好的建议，也期待大家的交流和意见！